Plattform 1

Die Plattform 1 wird Genom-Mining und Protein-Engineering mit einem automatisierten Screening der Plasmamembran-Expression und automatisierten Photostrommessungen kombinieren, um optogenetische Aktoren für die vorgeschlagenen optogenetischen Therapien zu entwickeln. Der umfangreiche Datensatz, der unter standardisierten Bedingungen gesammelt wurde, wird darüber hinaus die Kartierung der Opsin-Fitness-Landschaft beschleunigen und als Grundlage für datengesteuerte Protein-Engineering-Ansätze dienen, die strukturgesteuerte Ansätze ergänzen und so die Entwicklung der nächsten Generation optogenetischer Aktoren beschleunigen werden.

Abbildung: Opsin-Entwicklungsplattform (P1). In enger Zusammenarbeit mit allen Light2Treet-Plattformen und Light2Treet-Teams wird die Opsin-Engineering-Plattform (P1) verbesserte ChRs und Opto-GPCRs entwickeln, um maximale Wirksamkeit mit minimalem Risiko von Nebenwirkungen zu kombinieren. Wir werden Opsine mit einem rotverschobenen Wirkungsspektrum, Plasmamembranlokalisierung, Hypoimmunogenität und geeigneter Kinetik entwickeln. (A-B) P1 wird Genom-Mining und Protein-Engineering einsetzen, um optogenetische Aktoren der nächsten Generation für zukünftige optogenetische Therapien zu entwickeln. Abgebildet sind ClustalW-Alignments und ein phylogenetischer Baum zur Identifizierung neuer natürlicher ChRs (A) und die hochauflösende Struktur eines ChR (ChR2-Struktur, PDB ID: 6EID) zur Identifizierung von Aminosäuren, die die Eigenschaften verbessern können. Wir werden 3D-Modelle (AlphaFold, DeepMind) und Kryo-EM-Analysen (Titan Krios G4, Kryo-EM-Plattform der Universität Göttingen) einsetzen, um Strukturinformationen in Fällen zu sammeln, in denen noch keine hochauflösenden Strukturen verfügbar sind (B). (C-D) Die Anwendung automatisierter Verfahren ermöglicht groß angelegte Screenings von Bibliotheken mit den gefundenen natürlichen Opsinen und vorgeschlagenen Opsin-Mutanten. Die etablierte Pipeline besteht aus dem auf Spinning-Disk-Mikroskopie basierenden CellVoyager CV8000 (Yokogawa), der für automatisierte Opsin-Plasmamembran-Expressions-Screenings verwendet wird (C), und dem Opto-SyncroPatch 384 (Nanion) für automatisierte Photostrommessungen (D), um die ChR-Eigenschaften zu analysieren. (E) Beispielhafter ChReef-Photostrom, gemessen mit dem Opto-SyncroPatch 384 bei -60 mV. Der umfangreiche Datensatz, der unter standardisierten Bedingungen gesammelt wurde, wird darüber hinaus die Kartierung der Opsin-Fitness-Landschaft beschleunigen und als Grundlage für datengesteuerte Protein-Engineering-Ansätze dienen, die strukturgeleitete Ansätze ergänzen und so die Entwicklung der nächsten Generation optogenetischer Aktoren beschleunigen werden.